養(yǎng)殖場專用非洲豬瘟檢測試劑盒（柱膜法）使用說明書

養(yǎng)殖場專用非洲豬瘟檢測試劑盒又稱環(huán)境檢測非洲豬瘟試劑盒，養(yǎng)殖場專用非洲豬瘟檢測試劑盒以探針法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測非洲豬瘟病毒的試劑盒。

【產(chǎn)品名稱】通用名稱：病毒DNA提取試劑盒

英文名稱：Extraction Kit for Virus DNA

【預(yù)期用途】本試劑盒主要用于疑似病毒等病原感染抗凝血、血淸、拭子、組織、飼料及環(huán)境中的病毒DNA的提取，純化的核酸可適用于各種常規(guī)操作及PCR試驗(yàn)。

【試劑盒組分】

I、試劑盒組成及貯藏條件 名稱 20T 50T

1、吸附柱 20個 50個 2、收集管 20個 50個 3、裂解液 5mL11mL4、洗液I13mL32mL5,洗液II13mL32mL6.洗脫液1.2mL3mL

2、保存條件及有效期：室溫下保存，有效期12個月.

3、需自備材料：無水乙醇、1.5mL無菌離心管、1.5mL無菌離心管（長臂型）、生理鹽水、研缽、無菌1mL,2OOuL、10uL槍頭、記號筆等。

【操作步驟】

一、樣品制備

1、血液樣品：抗凝血樣品置離心管中，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取上層血漿；非抗凝血樣品置離心管中，待凝固后，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取上層血清，置于滅菌離心管中，編號待檢。

2、組織樣品：采集脾臟、肝臟、淋巴結(jié)、扁桃體等病變組織樣品0.1g.組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，加入1mL生理鹽水混勻，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取上清于滅菌離心骨中，編號待檢。

3、口腔液：進(jìn)食前用拭子/口腔液采集袋或自制棉線綁紗布團(tuán)吸引動物咀嚼，收集口腔液大于500uL，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取上清于滅菌離心管中，編號待檢。

4、飼料：取適量研磨后的飼料（約0.2g），放入含1mL生理鹽水或PBS（PH為7.4）緩沖液的2mLEP管屮，振蕩混勻，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取上清于滅菌離心管中,編號待檢.

5、灰塵：用無菌棉簽蘸取適量環(huán)境表面上的灰塵，放入含1mL生理鹽水或PBS（PH為7.4）緩沖液的2mLEP管中，振蕩混勻，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取上清于滅菌離心管中，編號待檢。

二、DNA的提取

1、取裂解液200uL加入無核酸酶1.5mL離心曾屮，分別加入血漿/血清/組織液等樣品液200uL.震蕩混勻10秒或顛倒混勻10次，室溫放置5分鐘（如果室內(nèi)溫度較低時.需放置25C水浴溫育），再加入200uL無水乙醇，顛倒混勻10秒；若樣品渾濁則先12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘處理，取上清液，以避免堵塞柱子；

2、將液體轉(zhuǎn)入套有收集管的吸附柱中，12000rpm離心1分鐘：

3、棄收集管液體，向吸附柱中加600uL洗液I,12000rpm離心1分鐘;

4、棄收集管液體，向吸附柱中加600uL洗液II，12000rpm離心I分鐘；

5、棄收集管液體，12000rpm離心2分鐘，以徹底去除殘留洗液；

6、將吸附柱轉(zhuǎn)入新的無核酸酸1.5mLEP管（長臂型）中，向柱中央滴加50uL洗脫液，靜置1分鐘,12000rpm離心1分鐘，EP管中液體即為病毒DNA。

【注意事項(xiàng)】1、實(shí)驗(yàn)前諾仔細(xì)閱讀本試劑盒說明書，嚴(yán)格按照操作步驟執(zhí)行.在操作過程中對時間、試劑體積等粘確控制可以獲得最好的結(jié)果

2,樣本應(yīng)新鮮采集使用，或低溫運(yùn)輸儲存；

3,樣本具有潛在感染風(fēng)險，核酸的提取應(yīng)在核酸提取實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜中進(jìn)行。

4、核酸提取冇關(guān)耗材確保高溫滅菌，提取后核酸盡快進(jìn)入下一步試驗(yàn)或冷凍保存待用。

5,試劑使用前應(yīng)混合均勻，試劑具有一定腐蝕性，使用時請戴手套、口罩做好防護(hù)。

6.低溫下裂解液出現(xiàn)結(jié)晶數(shù)屬正?，F(xiàn)象，可在60°C水浴加熱助溶后使用。

7、實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)及時收集，遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行無害化處理。

僅供獸醫(yī)診斷使用

非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測試劑盒說明書【獸藥名稱】

通用名稱：非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測試劑盒

漢語拼音:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe

英文名稱：African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit

商品名稱：無

【主要成分與含量】試劑盒中含有如下組分:試劑盒組分含量，陽性對照250μL/管×1管，陰性對照250μL/管×1管，PCR反應(yīng)液850μL/管×1管，萌混合液150μL/管×1管，說明書1份/盒

【作用與用途】本試劑盒可用于血液、脾臟、肝臟、淋巴結(jié)、樣品中非洲豬瘟病毒核酸的檢測。扁桃體、腎臟、肌肉、環(huán)境樣品等

【用法與判定】

1用法

1.1待檢樣品釆集、保存及運(yùn)輸

1.1.1樣品釆集

（1）活豬樣品 無菌采集抗凝血或血清5mL

（2）病死豬剖檢樣品或屠宰場剖檢樣品，無菌采集死豬的牌、肺、腎、扁桃體、淋巴結(jié)、肌肉等組織樣品。2?8°C低溫運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室用于檢測。

（3）病豬污染的周邊環(huán)境 采集與病豬相關(guān)場所的糞便、飼料、污水樣品。2?8°C低溫運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室用于檢測。

1.1.2樣品保存

采集的樣品在2?8°C保存應(yīng)不超過24小時，-70°C條件下保存，避免反復(fù)凍融。

1.1.3樣品運(yùn)輸

泡沫箱加冰袋后密封進(jìn)行運(yùn)輸。包裝和運(yùn)輸應(yīng)符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《高致病性動物病原微生物菌（毒）種或者樣品運(yùn)輸包裝規(guī)范》和交通運(yùn)輸部門關(guān)于危險品運(yùn)輸管理的有關(guān)規(guī)定。

1.2樣品處理

1.2.1血液樣品處理

抗凝血樣品置于離心管中，8000r/min離心2分鐘取上層血漿，編號待檢。非抗凝血樣品置于離心管中，待凝固后，8000r/min離心2分鐘取200μL上層血清，編號待檢。

1.2.2組織樣品處理

取適量脾臟、肝臟、淋巴結(jié)、扁桃體、肌肉等組織，置于研磨器或研磨管中研磨，再加適量生理鹽水混勻，制成約10%的組織勻漿，8000r/min離心2分鐘，取200μL上 清于RNase/DNase-free無菌離心管中，編號備用。

1.2.3環(huán)境樣品處理

1.2.3.1糞便、飼料樣品處理方法

取適量的糞便、飼料放入盛有PBS緩沖液的研磨管中研磨混勻，制成約10%的勻漿液.8000r/min離心2分鐘，取200μL上清于RNase/DNase-free無菌離心管中，編號備用。

1.2.3.2污水樣品處理方法

直接取200μL污水進(jìn)行核酸提取。

1.3病毒核酸的提取用磁珠法或柱式法進(jìn)行DNA核酸提取。

1.4熒光PCR反應(yīng)：

1.4.1從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液、酶混合液，室溫融化后，2000r/min離心5秒。設(shè)被檢樣品、陽性對照和陰性對照總和為n,則反應(yīng)體系配制如下：

試劑體系

PCR 反應(yīng)液17× (n+1) μL

酶混合液3× (n+1) μL

1.4.2在新的RNase/DNase-fire1.5mL離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20μL/管分裝量將試劑分裝至熒光PCR反應(yīng)管。

1.4.3在上述制備好的熒光PCR反應(yīng)管中分別加入陰性對照、陽性對照各5μL、處理好的待測核酸各5μL,終體積25μL/管，蓋好熒光PCR反應(yīng)管蓋，混勻后瞬時離心，轉(zhuǎn)移到熒光PCR儀器 上。

144將PCR反應(yīng)管放置在熒光PCR儀樣品槽中，在熒光PCR儀上運(yùn)行以下程序：

步驟 條件 循環(huán)數(shù) UNG處理 50℃,2分鐘1 預(yù)變性 95℃,3分鐘1 預(yù)擴(kuò)增 95℃：8秒55℃：8秒5 PCR擴(kuò)増 95℃：8秒55℃：8秒40

熒光通道選擇FAM,在PCR擴(kuò)增階段每個循環(huán)的55℃時采集熒光信號。設(shè)置擴(kuò)增體系為25μL,同時要選擇passive reference和quencher為none的模式。（注：若熒光PCR儀（如AB17500）按說明 書中的反應(yīng)程序設(shè)置后因持溫時間短無法運(yùn)行，可將預(yù)擴(kuò)增和PCR擴(kuò)增條件變更為95C：5秒55°C：30秒）

2結(jié)果判定

2.1試驗(yàn)有效性判定

陽性對照有典型擴(kuò)增曲線且Ct值≤30.且陰性對照無Cl值或無擴(kuò)增曲線，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。則判試驗(yàn)結(jié)果有效。否則，此次試驗(yàn)視為無效。

2.2樣品判定

2.2.1陽性：樣本檢測結(jié)果Ct值≤35且有明顯指數(shù)增長期，判定檢出非洲豬瘟病毒核酸。

2.2.2可疑：樣本檢測結(jié)果Ct值在35?38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對樣本進(jìn)行重復(fù)檢測，如果重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35?38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期.則判定為陽性，否則為陰性。

2.2.3陰性：樣本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值，判定未檢出非洲豬瘟病毒核酸。

【注意事項(xiàng)】（1）實(shí)驗(yàn)前請仔細(xì)閱讀本試劑盒說明書，嚴(yán)格按照操作步驟執(zhí)行，在操作過程中對時間、試劑體積等精確控制可以獲得最好的結(jié)果。

（2）實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照有關(guān)規(guī)定分區(qū)管理，依照配液區(qū)-模板提取區(qū)-擴(kuò)增區(qū)-分析區(qū)順序進(jìn)行基因檢測。各區(qū)間人員、器材、試劑及空氣流向應(yīng)有嚴(yán)格要求。

（3）核酸提取有關(guān)耗村確保潔凈、無DNase/RNase,提取過程盡量低溫、快速，完成后進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)或凍保。

（4）對于頂部采光儀器要帶新的一次性PE手套對熒光PCR管封蓋，對于底部采光儀

器要避免徒手或使用過的手套接觸熒光PCR管底，檢測過程中使用不帶熒光物質(zhì)一次性乳膠手套。

（5）凍存試劑使用前應(yīng)于室溫下完全融化，瞬時離心使液體完全沉于管底。避免反復(fù)凍融，以免影響試劑性能。

（6）樣品、陽性對照等在使用后及時封蓋，.避免組分間及氣溶膠等的污染造成假陽性。

（7）擴(kuò)增產(chǎn)物禁止開蓋，實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)及時收集，遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行無害化處理。

【規(guī)格】50頭份/盒

【貯藏與有效期】試劑盒置-20°C以下避光保存，有效期12個月。

【批準(zhǔn)文號】獸藥生字163668871

僅供獸醫(yī)診斷使用